清華大學生命學院首次體外應用Cas9系統實現對上百kb的基因組片段的靶向克隆

 9月1日，清華大學生命科學學院朱聽研究員課題組在《自然-通訊》上在線發表了題為《CATCH技術實現大型基因簇一步法靶向克隆》的論文，首次體外應用Cas9系統實現對上百kb的基因組片段的靶向克隆。

　　分子克隆技術已被廣泛應用于現代生物學的各個領域，但傳統的PCR（聚合酶鏈式反應）技術通常很難一步得到15 kb以上的片段，傳統的限制性核酸內切酶識別位點僅6-8個堿基，對生物基因組不能有效實現特異性，因此對于較長目標片段的克隆或合成始終存在陽性率低，步驟復雜，成本高等問題。近年來人們在細菌中發現的CRISPR系統可以實現對外源序列的特異性識別和有效切割，在此基礎上，科學家們開發出許多基因編輯、基因表達調控，體內成像等工具。然而對該系統的體外應用則鮮有報道。朱聽課題組利用體外轉錄制備的sgRNA和表達純化的Cas9蛋白特異性酶切目標全基因組，并通過同源序列互補將長達100 kb的目標片段一步連接到細菌人工染色體上實現特異性克隆。通過脈沖場電泳可以清晰觀察到目標大片段從全基因上的有效分離，其克隆效率可與普通短片段克隆相當。

　　該技術的開發將極大簡化對能夠表達具有高附加值生物大分子的基因簇的克隆步驟，節省時間并降低成本，該技術有望廣泛應用于合成生物學、基因測序、精準醫療等領域。

　　本課題得到科技部、國家自然科學基金委、清華-北大生命科學聯合中心、感染性疾病診治協同創新中心的經費支持。